時間：2023-12-20 11:36:34
緒論：在尋找寫作靈感嗎？愛發表網為您精選了8篇生物細胞的功能，愿這些內容能夠啟迪您的思維，激發您的創作熱情，歡迎您的閱讀與分享！
一、知識結構二、教學目的
1.細胞質基質內含有的物質和細胞質基質的主要功能(C：理解)。
2.線粒體和葉綠體的基本結構及主要功能(C：理解)。
3.內質網、核糖體、高爾基體、中心體、液泡這幾種細胞器的主要功能(C：理解)。
三、重點和難點
1.教學重點
(1)線粒體和葉綠體的基本結構及主要功能。
(2)內質網、核糖體、高爾基體、中心體、液泡的主要功能。
2.教學難點
線粒體和葉綠體的基本結構和主要功能。
四、教學建議
本小節的教學內容，應結合學生實驗統籌考慮。例如，細胞質的概念、組成部分(基質、細胞器)的關系、葉綠體的結構和功能等內容，可以在有關的學生實驗中學習。
關于細胞質的教學，重點是講述各種細胞器的結構成分、結構特點和主要功能。根據學生的接受能力，可對結構與功能相適應的特點，各種結構功能之間的聯系，進行不同程度的分析。
在講述線粒體時，要充分利用教材中的示意圖，讓學生注意觀察線粒體的結構特點和它浸浴在細胞質基質中的狀況。在分析線粒體外膜時，一方面要指出外膜使線粒體相對獨立于細胞質基質；另一方面又要指出，通過外膜使細胞質基質與線粒體內部進行著物質交換。在分析線粒體內膜時，要注意使學生理解內膜的折疊增加了內膜的表面積，這有利于有氧呼吸酶系的附著，有利于有氧呼吸的化學反應大量地進行。
講述葉綠體時，要在對葉綠體成分和結構特點的分析中，滲透出它與高效利用光能(如基粒中垛疊的囊狀結構)，完成光合作用一系列反應(如含光合作用的色素、酶)是相適應的。在教學中，可適當對比線粒體和葉綠體。
關于內質網的教學，要盡可能利用立體結構示意圖，使學生正確理解內質網的結構特點和在細胞質中的狀況。關于內質網的作用，一方面擴大了細胞內的膜表面積，形成了物質運輸通道；另一方面與脂質、糖類和蛋白質的合成有密切關系。
在講述核糖體時，要注意引導學生觀察插圖，知道有的核糖體附著在內質網膜的外側，有的游離在細胞質的基質中，因此，核糖體和內質網是相對獨立的兩種細胞器。要指出核糖體無膜結構，它是合成蛋白質的場所(如果時間允許，還可以回顧氨基酸縮合成肽的知識)。如果學生條件較好，教學中可適當滲透出附著的和游離的這兩類核糖體所合成的蛋白質的去向有所不同。附著在內質網上的核糖體合成的蛋白質進入內質網腔中，繼續進行加工并被運輸。
關于高爾基體的教學，要結合細胞結構圖，說明它與內質網、細胞膜的相互聯系，理解高爾基體對細胞分泌物的形成、加工和轉運的作用。在植物細胞中，它合成的纖維素對細胞壁的形成有重要作用。
對于中心體和液泡的教學，不必擴展，有些作用可結合后面有關知識進行講述。
本小節教學的總結，可以用動物或植物細胞的整體示意圖，分析各種細胞器之間的結構聯系和功能聯系。
五、參考答案
復習題一、1.線粒體，內質網，染色質，高爾基體，中心粒。2.〔4〕高爾基體。3.〔2〕內質網。4.〔5〕中心體。5.〔1〕線粒體。
二、1.(C)；2.(B)；3.(C)；4.(B)；5.(A)；6.(B)。
三、在葉綠體的3、4部分。
實驗討論題1.葉綠體在細胞質基質中不是靜止不動的。呈橢球體形的葉綠體在不同的光照條件下可以運動，這種運動能夠隨時改變橢球體的方向，使葉綠體既能接受較多的光照，又不至于被強光灼傷。
2.葉綠體的形態和分布都有利于接受光照，完成光合作用。如葉綠體呈橢球形，它能夠在不同光照條件下改變方向。又如，葉肉細胞中的柵欄組織，其中的葉綠體分布比海綿組織的多，這可以接受更多的光照。
3.細胞質基質中含有多種無機化合物和有機化合物，還有很多種酶。細胞質基質是活細胞進行新陳代謝的主要場所。植物細胞中細胞質的流動，有利于細胞內物質的運輸和細胞器的移動，從而為細胞內的新陳代謝提供所需要的物質和有關條件。
六、參考資料
細胞質的概念廣義地說，就真核生物而言，在細胞膜以內，除了細胞核以外的其他部分，都屬于細胞質。但是狹義地說，細胞質是指細胞質的可溶相，即指除了細胞質中的細胞器和內含物以外的基質部分。這部分在光學顯微鏡下，看不出有任何定形的結構，是均勻透明的，所以稱為透明質，也稱為細胞液、細胞基質或細胞質基質?？墒?，細胞有許多復雜的運動現象，又啟發細胞學研究者考慮到細胞質的結構可能不會這樣簡單。電子顯微鏡的使用，使我們對于細胞的超微結構有越來越深入的了解。在20世紀60年代，科學家發現細胞質基質是一種呈連續相的物質。
真核細胞和原核細胞的細胞質，包含著相同的組成成分：核糖體、RNA分子、球蛋白、酶等。細胞質內蛋白質和酶的含量占細胞的蛋白質總量的20%～25%。在細胞質中最重要的可溶性酶，是與糖酵解及與蛋白質合成中氨基酸有關的一些酶。此外，許多需要ATP參與反應的酶及可溶性轉移酶，也存在于細胞質中。
緊貼在細胞膜下面的細胞質，被認為是一種高度異質的膠體系統。細胞學家早就發現細胞質有彈性和黏滯性，也看到布朗運動和細胞質川流運動。這就證明細胞質的結構不是始終如一，而是隨著溫度、日光、壓力等環境條件而改變的。近些年來，利用電鏡技術，尤其是高壓電鏡技術和生化、免疫技術，發現細胞質的確不是均一的，其中含有光學顯微鏡下看不到的超微結構。目前，細胞生物學家已經闡明：細胞質是一個錯綜復雜的、相互聯系的、高度有序的網絡結構。這些細胞質網絡結構，可用“細胞質基質”這個專有名詞表達。也就是說，細胞質基質這個名詞，除包括組成細胞骨架的三種主要纖絲──微絲、微管和中間纖維，以及一個由纖絲橋所組成的相互交聯的絲狀結構──微梁系統(或微梁網格)外，還包括和它們有聯系的蛋白質和水分。
細胞質的功能細胞質具有多方面的功能。但是，由于它本身太脆弱，以致生理學家至今不能用很好的方法來驗證它的真正的生理功能。不過，毫無疑問，細胞質對細胞生命活動有著極其重要的作用。從生物學的角度和細胞質中的各種物質來看，它具有以下幾方面的功能。
1.管制外來物質進入細胞內或排出細胞外的作用，以及調節細胞質的“水化”作用。
2.對于如鞭毛和纖毛等后成質的形成，以及對于細胞內含物的儲藏具有重大作用。例如，蛋白質、脂肪粒、肝糖元、植物堿等多數集存在細胞質內。
3.為維持細胞器實體的完整性，提供所需要的離子環境。
4.供給細胞器行使功能所必須的一切底物。，全國公務員共同天地
5.影響細胞的分化。例如在胚胎發育過程中，細胞質對于分化起著很重要的作用。這已經為實驗胚胎學的大量事實所證實。
6.進行某些生化活動，如上面提到的糖酵解、核酸、脂肪酸和氨基酸代謝的某個階段，需要依靠細胞質中處于相對游離狀態的酶來完成。
細胞質流動在活細胞中，細胞質以各種不同的方式在流動著，包括細胞質環流、穿梭流動和布朗運動等，這些也同微絲和微梁系統的存在有密切的關系。
1.細胞質環流。是細胞質流動的一種形式。在液泡發達的植物(如黑藻、輪藻、伊樂藻)細胞中，細胞質成薄層沿著細胞膜以一定的速度和方向循環流動。這種不斷地循環流動稱為細胞質環流。環流的速度，伊樂藻是10μm／s，輪藻是50μm／s。普通植物細胞則是每秒幾微米至幾十微米。
2穿梭流動。穿梭流動是細胞質流動的另一種形式，它與環流不同，是向相反方向來回穿梭。由于流動方向在一定時間內來回交換，因此叫穿梭流動。絨泡菌是研究這種流動的最好材料。它是一種黏菌，是多核的細胞質團，沒有細胞的分隔。黏菌的外緣是凝膠樣的外質，核心是溶膠樣的內質。在內外質中含有許多葉脈狀的微細分支，在中央集攏在一起成為主脈，細胞質就從支脈向主脈流動(圖2-5，1、2)。內質的流動速度很快，為1.3mm／s，比細胞質環流快得多。這樣，絨泡菌一頭的體積縮小，另一頭的體積增大，長出偽足狀的突起，就暫時停止流動(圖2-5，3)，隨后就又開始逆向流動(圖2-5，4、5)，來回穿梭進行。
3.布朗運動。在活細胞中可以看到細胞質內的許多小顆粒在無規則地跳動著，這在暗視野顯微鏡下觀察更為明顯，叫做布朗運動。布朗運動的產生除了與微絲的存在有關外，還與微梁網格的收縮有關。
圖2-5絨泡菌中細胞質的穿梭流動
1.2.細胞質從左向右流動3.右側形成偽足突起，流動暫停
4.5.細胞質又向相反方向從右向左流動。箭頭長度表示流動速度。
線粒體細胞的有氧呼吸主要是在線粒體內進行的。線粒體的內部結構，在光學顯微鏡下不能分辨，只有在電子顯微鏡下才能看清楚。線粒體由內外兩層膜組成。外膜即界限膜，使線粒體與周圍的細胞質分開，是各種分子和離子進入線粒體內部的障壁。內膜的不同部位向線粒體的中心腔折疊，形成嵴。這樣就大大增加了酶分子附著的表面，并且把酶分子密集地包在線粒體里。內膜和外膜在化學成分和物理特性上都有顯著的差異。例如，它們在蛋白質的含量，特別是在類脂的分布上是很不相同的。外膜比內膜的磷脂含量要高2～3倍；外膜的通透性也比內膜高得多。外膜的通透性高，為線粒體與周圍細胞質之間進行充分的物質交換提供了條件。內膜的通透性差，可以使催化三羧酸循環的復雜酶系統保留在內膜的間隔中，從而保證細胞有氧呼吸的進行。線粒體膜上還具有小孔，這樣，有氧呼吸所產生的ATP可以更容易地向線粒體外面擴散。
線粒體既然是細胞進行有氧呼吸的主要場所，那么，有關催化三羧酸循環、氨基酸代謝、脂肪酸分解、電子傳遞、能量轉換、DNA復制和RNA合成等過程所需要的100多種酶和輔酶，都分布在線粒體的外膜上、膜內空間及內膜和基質中。這些酶和輔酶的主要功能是參加三羧酸循環中的氧化反應、電子傳遞和能量轉換。
內質網粗面型內質網又叫做顆粒型內質網，常見于蛋白質合成旺盛的細胞中。粗面型內質網大多為扁平的囊，少數為球形或管泡狀的囊。在靠近核的部分，囊泡可以與核的外膜連接。粗面型內質網的表面所附著的核糖體(也叫核糖白體)是合成蛋白質的場所，新合成的蛋白質就進入內質網的囊腔內。粗面型內質網既是新合成的蛋白質的運輸通道，又是核糖體附著的支架。
滑面型內質網又稱為非顆粒型內質網?；嫘蛢荣|網的囊壁表面光滑，沒有核糖體附著。滑面型內質網的形狀基本上都是分支小管及小囊，有時小管排列得非常緊密，以同心圓形式圍繞在分泌顆粒和線粒體的周圍。因此，滑面型內質網在切面中所看到的形態，與粗面型內質網有明顯的不同。
滑面型內質網與蛋白質的合成無關，可是它的功能卻更為復雜，它可能參與糖元和脂質的合成、固醇類激素的合成以及具有分泌等功能。在胃組織的某些細胞的滑面型內質網上曾發現有Cl-的積累，這說明它與HCl的分泌有關。在小腸上皮細胞中，可以觀察到它與運輸脂肪有關。在心肌細胞和骨骼肌細胞內的滑面型內質網，可能與傳導興奮的作用有關；在平滑肌細胞內，卻發現它與Ca2+的攝取和釋放有關。
核糖體核糖體是由核糖體的核糖核酸(符號為rRNA)和蛋白質構成的橢圓形的粒狀小體，其中rRNA和蛋白質的比例為1∶1。蛋白質分子基本上排列于核糖體的表面上，rRNA分子被包圍于中央。細胞內有的核糖體附著于內質網的外面，稱為固著核糖體，與內質網形成上面所談到的粗面型內質網；有的不附著于內質網上，稱為游離核糖體，常見于未分化的細胞中。附著于內質網上的核糖體，附著的情況也不相同。在某些細胞中，核糖體均勻地附著于細胞質中某一部分的內質網上；有的卻集中地附著于細胞質中某一部分的內質網上。
核糖體是細胞內合成蛋白質的場所?，F在已知，附著于內質網上的核糖體所合成的蛋白質，與游離于細胞質基質中的核糖體所合成的蛋白質有所不同。附著于內質網上的核糖體，主要是合成某些專供輸送到細胞外面的分泌物質，如抗體、酶原或蛋白質類的激素等；游離核糖體所合成的蛋白質，多半是分布在細胞質基質中或供細胞本身生長所需要的蛋白質分子(包括酶分子)，此外還合成某些特殊蛋白質，如紅細胞中的血紅蛋白等。因此，在分裂活動旺盛的細胞中，游離核糖體的數目就比較多，而且分布比較均勻。這一點已被用來作為辨認腫瘤細胞的標志之一。
不管是附著的核糖體還是游離的核糖體，在進行蛋白質合成的過程中，常常是幾個核糖體聚集在一起進行活動，這是由于信息核糖核酸(mRNA)把它們連串在一起。這樣的一個功能單位的聚合體稱為多聚核糖體。
高爾基體高爾基于細胞核附近的細胞質中，它的形狀一般呈網狀。在不同的生理情況下，可以轉變為顆粒狀、桿狀或其他形狀。在電鏡下，高爾基體是一些緊密地重疊在一起的囊狀結構。有些膜緊密地折疊成片層狀的扁平囊，有些扁平囊的末端膨大成大小不等的泡狀或囊泡狀結構。
在有的電鏡照片上，可以看到這些膜是與內質網相連通的，還可以觀察到若干跡象，表明這些小囊泡可以連接于扁平囊，而成為扁平囊的一部分，扁平囊也可以在其末端部分脫落而形成小囊泡。另外，扁平囊也可以在囊腔中積累物質，逐漸膨大而形成大囊泡?？梢?，組成高爾基體的小囊泡、層狀扁平囊和大囊泡三部分并不是固定的結構，而是相互有關系的，它們是高爾基體功能活動不同階段的形態表現。
高爾基體在細胞內的位置和分布情況，與它在不同細胞內的功能有關。高爾基體的大小和在細胞內的數量，因細胞的類別和生理狀況不同而有所不同。
高爾基體的主要功能有三方面。一是與分泌有關。早期根據光鏡的觀察，已有人提出高爾基體與細胞的分泌活動有關。后來，運用電鏡、細胞化學及放射自顯影技術更進一步證實和發展了這個觀點。高爾基體在分泌活動中所起的作用，主要是將粗面型內質網運來的蛋白質類的物質，進行加工(如濃縮或離析)、儲存和運輸，最后形成分泌泡。當形成的分泌泡自高爾基囊泡上斷離時，分泌泡膜上帶有高爾基囊膜所含有的酶，還能不斷起作用，促使分泌顆粒不斷濃縮、成熟，最后排出細胞外。最典型的，如胰外分泌細胞中所形成的酶原顆粒。放射自顯影技術證明，高爾基體自身還能合成某些物質，如多糖類。它還能使蛋白質與糖或脂結合成糖蛋白或脂蛋白的形式。在某些細胞(如肝細胞)中，高爾基體還與脂蛋白的合成、分泌有關。二是與溶酶體的形成有關?，F在一般都認為初級溶酶體的形成過程與分泌顆粒的形成類似，也起自高爾基體囊泡。初級溶酶體與分泌顆粒(主要指一些酶原顆粒)，從本質上看具有同一性，因為溶酶體含多種酶(主要是各種水解酶)，都是蛋白質；與酶原顆粒一樣，也參與分解代謝物的作用。不同處在于：酶原顆粒是排出細胞外發揮作用，而溶酶體內的酶類主要在細胞內起作用。三是高爾基體還有其他功能，如在某些原生動物中，高爾基體與調節細胞的液體平衡有關系。
【摘要】 目的?：探討牛膝多糖(AbP)及其硫酸酯和磷酸酯衍生物對糖尿病(DM)大鼠胰島細胞形態和腎功能的影響。方法：以鏈脲佐菌素誘導SD大鼠致DM模型，觀察AbP、牛膝多糖硫酸酯衍生物(S-AbP)和牛膝多糖磷酸酯衍生物(P-AbP)對DM大鼠血糖、胰島細胞形態和分泌的影響;測定血清肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)水平，觀察其對DM大鼠腎功能的影響。結果：AbP及其兩種衍生物均可明顯降低DM大鼠的血糖濃度(P?
【關鍵詞】 牛膝;多糖;衍生物;糖尿病;胰島細胞;腎功能;大鼠
Abstract: ? Objective: To study the effects of Achyranthes bidentata polysaccharides (AbP) and the sulfated derivative (S-AbP) and the phosphorylated derivative?(P-AbP)?of AbP on the morphology of islet cells and renal function in diabetic rats. Methods:?Diabetes was induced by a single injection of streptozotocin， changes of fasting blood glucose and morphology and secretion of islet cells in diabetic rats treated respectively with S-AbP，P-AbP and AbP were observed，the renal function was also evaluated by examining serum creatinine (Scr) and blood urea nitrogen (BUN). Results:?Compared with diabetes group， the blood glucose significantly decreased in S-AbP， P-AbP and AbP treated group(P?
Key words: ?Achyranthes bidentata Blurne;Polysaccharides;derivative;diabetes;islet cells;renal function;rats
糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一組由胰島素分泌缺陷或生物學作用障礙引起的以高血糖為主要特征的常見內分泌代謝疾病。DM并發癥累及多器官系統的功能損害。進行性胰島β細胞毀損，胰島素分泌缺乏是1型DM的主要病理生理特征，也是其發生發展的驅動因素[1]。我們以往的研究已經證實牛膝多糖(Abp)衍生物對DM大鼠肝、腎氧化應激損傷有明顯的保護作用，對DM大鼠的高血糖、高血脂狀態具有一定改善和控制作用[2-3]。本實驗擬通過觀察Abp及其衍生物對鏈脲佐菌素誘導的DM大鼠胰島細胞形態結構、血清肌酐和尿素氮含量等的影響，旨在探討其對DM大鼠胰島β細胞、腎功能損傷的保護作用及其可能機制。
1??材料和方法
1.1??實驗動物??清潔級(II級)雄性SD大鼠，體重200～250 g，由溫州醫學院實驗動物中心提供，實驗動物許可證號sysxk(浙)2005-0061。
1.2??主要藥品與試劑??AbP中科院上海有機化學研究所，純度：99.8%);牛膝多糖硫酸酯(S-AbP，本實驗室參考田庚元[4]的方法，采用氯磺酸-吡啶法自制，多糖酯含量91.3%，取代度2.39);牛膝多糖磷酸酯(P-AbP，本實驗室參考田庚元[5]的方法，以三氯氧磷為磷酸化試劑自制，多糖酯含量86.5%，取代度0.70);鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)由Sigma公司出品，臨用前以無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制成pH 4.2、濃度為2.5 mg·mL-1的工作液;消渴丸，廣州中一藥業有限公司(批號為J00387);HE染液(南京建成生物工程公司);兔抗鼠胰島素抗體(北京博奧森生物技術有限公司);山羊抗兔IgG抗體，DAB顯色試劑盒(北京天來生物公司);其他均為國產分析純。
1.3??動物模型制備、分組與給藥??SD大鼠適應性喂養1周后，隨機取出6只作為正常對照(NC)組，除NC組外，其余的大鼠禁食12 h后，按55 mg·kg-1劑量一次性腹腔注射新配制的STZ，NC組給予0.1 mol·L-1 pH 4.2檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射。注射后72 h，尾部采血測空腹12 h的血糖，把血糖值高于16.8 mmol·L-1并穩定1周的大鼠定為DM大鼠。將DM大鼠隨機分為5組，每組6只動物，即模型DM組、消渴丸(XK)組、S-AbP組、P-AbP組及AbP組。NC組和DM組按0.1 mL·kg-1灌胃蒸餾水，XK組按1.5 g·kg-1灌胃消渴丸，S-AbP組、P-AbP組和AbP組分別按100 mg·kg-1灌胃S-AbP、P-AbP和AbP，每天灌胃1次，并且每隔2 d 稱體重1次，及時調整灌胃劑量。各組大鼠在室溫24～26 ℃下用同種飼料飼養，持續灌胃30 d后處死。
1.4??血糖、血清肌酐(SCr)和尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)含量測定??大鼠禁食12 h后乙醚麻醉，眼眶后靜脈叢取血， 37 ℃溫浴10 min，以3?000 r/min速度離心10 min，取上清500μL，用日立7170全自動生化分析儀測定血糖、Scr和BUN水平。
1.5??胰腺組織HE染色??大鼠處死后立即取胰腺組織，放入新鮮配制并4 ℃預冷的4%多聚甲醛內固定24 h，常規脫水，透明，石蠟包埋制成石蠟切片，HE染色，光鏡觀察。
1.6??胰腺組織免疫組化染色??免疫組化染色按SP試劑盒說明進行操作，DAB染色，蘇木素復染，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察，拍照。
1.7??統計學處理方法??以one-way ANOVA分析各組別之間的差異，各組間均數比較采用LSD檢驗。
2??結果
2.1??S-AbP和P-AbP對糖尿病大鼠血糖水平的影響
??藥物治療前，DM組和各治療組間大鼠血糖濃度差異無顯著性，但均明顯高于NC組(均P?
2.2??S-AbP和P-AbP對糖尿病大鼠Scr和BUN水平的影響??DM組大鼠Scr和BUN水平顯著高于NC組(P
2.3??S-AbP和P-AbP對糖尿病大鼠胰島病理形態學的影響??見圖2，NC組大鼠胰島數目較多，呈現圓形或橢圓形細胞團狀，邊界清楚;胰島內細胞數目較多，排列整齊，胞漿豐滿，核多為圓形。DM組大鼠胰島數目稀少，胰島內細胞排列不規則，邊界不清，胰島細胞核大小、形態不規則，部分胰島細胞發生空泡變性，也有淋巴細胞浸潤現象。XK組和S-AbP組與DM組相比病變較輕，胰島內細胞數目增多，分布規則，胞漿飽滿，細胞核大小形態接近正常。P-AbP組和AbP組的胰島病變也較DM組輕。
2.4??S-AbP和P-AbP對DM大鼠胰島素表達的影響??胰島β細胞分泌的胰島素與其特異性的抗體結合后呈現棕褐色顆粒。NC組大鼠胰島內充滿β細胞(胰島素陽性反應細胞)，分泌顆粒豐富(棕褐色)，著色深。DM組大鼠胰島內β細胞分布稀少，分泌顆粒較少，著色較淺。XK組和S-AbP組大鼠與DM組大鼠相比胰島素陽性反應細胞較多，分泌顆粒較多，著色較深。P-AbP組和AbP組大鼠也有少數著色較深的分泌顆粒，見圖3。
3??討論
STZ是一種廣譜抗生素，具有抗菌、抗腫瘤的性能和致DM的作用，對實驗動物的胰島β細胞具有高度選擇性的毒性作用，引起胰島素分泌絕對不足。STZ誘導的DM與人類1型DM的臨床表現、過程及胰島的改變等方面有許多相似之處。此模型具有制造方法簡便、藥物毒性較低、胰島β細胞損傷特異性高等優點，是目前國內外研究1型DM較理想的動物模型[6]。在本實驗中，大鼠經用STZ腹腔注射后，血糖顯著升高，而胰腺病理學檢查顯示胰島數目減少，β細胞分泌顆粒減少，即胰島素合成分泌不足，從而誘發大鼠致1型DM。
AbP是從牛膝中提取的一種小分子水溶性多糖，具有降血糖、免疫調節和活血化瘀等功能[7]。多糖衍生化是提高多糖活性的重要手段，一些本來無活性的多糖經過衍生化后活性可大大改善。硫酸酯化和磷酸酯化是多糖的重要衍生化方法[8]。本實驗顯示，DM大鼠予以S-AbP、P-AbP和AbP治療后，血糖明顯降低，胰島β細胞數量增加，增生肥大的β細胞容積基本恢復正常，胰島素分泌功能顯著改善，表明S-AbP、P-AbP和AbP對DM大鼠胰島β細胞具有一定的保護和修復作用。本實驗同時發現S-AbP、P-AbP對DM大鼠胰島β細胞的保護作用優于AbP，這可能是AbP經硫酸化或磷酸化修飾后，構象改變，抗氧化、清除自由基等能力增加，顯示出更高的生物學活性或新的生理活性[2，9]，因而對胰島β細胞起到更好的保護作用。
DM大鼠血糖長期居高不下，會導致腎臟出現腎小球增生肥大、基底膜增厚等病理改變，繼而影響腎功能。我們的研究表明S-AbP、P-AbP和AbP能在一定程度上減輕DM大鼠腎臟的病變程度(已于另文報道)。Scr和BUN是反映機體腎功能的重要指標，本研究發現DM大鼠Scr、BUN含量升高，P-AbP、AbP使DM大鼠Scr含量明顯降低，S-AbP使DM大鼠Scr、BUN水平都顯著降低，表明S-AbP和P-AbP、AbP對DM大鼠腎功能有一定的保護作用。
總之，本實驗從生化、胰島細胞形態學角度證實，S-AbP、P-AbP和AbP可改善DM大鼠高血糖狀態，保護腎功能，對胰島β細胞功能具有一定的保護作用，且S-AbP和P-AbP的作用優于AbP。AbP具有抗氧化[2]、調節機體免疫[10]、降血脂[3]等作用，而且較之靈芝多糖、香菇多糖等，AbP具有相對分子質量小，水溶性好，藥源廣泛，使用方便(既可口服，又可注射)等優點。因此，作為一類新型的降糖藥物，AbP尤其是其衍生物，具有廣闊的醫藥開發和應用前景。
參考文獻
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本研究從[專業提供寫作論文和論文寫作服務，歡迎您的光臨dylw.net]種植體周圍炎患者脫落種植體周圍骨組織中獲取成骨細胞，通過對炎癥與正常組織來源的成骨細胞進行對比，探討種植體周圍炎對成骨細胞生物學行為的影響，為種植修復提供理論基礎。
1 材料和方法
1.1 臨床樣本收集
種植體周圍炎的骨組織樣本來自中國總醫院種植科，選取患者年齡小于等于60歲、種植體植入年限小于等于3年、種植于磨牙區且因種植體周圍炎出現種植體脫落的患者4例，刮取種植體附著以及種植窩中的骨組織。正常組織來源的樣本來自中國總醫院口腔外科，選取4例身體健康的相同年齡段的第三磨牙拔除術患者，夾取舌側骨板。所有患者均排除牙周炎，且近期沒有急性感染、糖尿病、家族遺傳病和骨質疏松癥等全身系統性疾病。本研究已經中國總醫院倫理委員會批準，且每例患者均簽署了知情同意書。
1.2 成骨細胞的分離培養與純化
PBS反復沖洗5次組織塊，將較大的組織塊剪為1 mm3大小，轉移至離心管中，加入含有13.7 g·L-1 Ⅳ型膠原酶（北京索萊寶科技有限公司）和5 g·L-1胰蛋白酶（Amresco公司，美國）的消化液，37 ℃震蕩消化45 min。1 000 r·min-1離心8 min，去上清，加入H-DMEM培養液（GIBCO公司，美國）和10%胎牛血清（Invitrogen公司，美國），吸管反復吹打成細胞懸液，接種培養皿中，置于37 ℃、5%CO2孵箱內培養。24 h后觀察細胞貼壁及生長情況，待鋪皿80%進行傳代。采用反復貼壁法[3]對細胞進行純化。
1.3 堿性磷酸酶鑒定染色
將第3代分離純化后的成骨細胞以每孔1×104個的密度接種于24孔板，細胞達70%時，用4%多聚甲醛在4 ℃固定30 min。PBS反復沖洗后，使用堿性磷酸酶試劑盒（Sigma公司，美國）染色1 h。PBS反復沖洗后，在倒置相差顯微鏡下進行常規觀察及照相。
1.4 MTT法檢測成骨細胞的增殖能力
取對數生長期第3代細胞，經胰蛋白酶消化后離心加入DMEM（10%胎牛血清）終止成細胞混懸液，調整密度為2×104個·mL-1接種于96孔板，每孔0.2 mL。貼壁后隔天換液，連續培養8 d。每隔24 h取3孔，每孔加入20 μL 5 g·L-1 MTT溶液，37 ℃、5%
CO2[專業提供寫作論文和論文寫作服務，歡迎您的光臨dylw.net]孵箱中孵育4 h，加入二甲基亞砜200 μL。采用酶聯免疫檢測儀490 nm波長下檢測吸光度值，實驗重復3次。
1.6 Western blot法檢測成骨細胞相關蛋白OCN的表達
取第3代細胞進行接種，培養7 d后，將細胞用0.01 mol·L-1 PBS反復沖洗3遍，裂解細胞提取蛋白。取等量蛋白經8%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將凝膠轉移到聚偏二氟乙烯膜上，脫脂奶粉封閉過夜。加入鼠抗人OCN（Abcam公司，英國）（1︰1 000稀釋）和β-actin（1︰2 000稀釋），37 ℃孵育2 h，洗膜后，經辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG2a（Abcam公司，英國）（1︰4 000稀釋）孵育50 min，化學發光法顯示抗原抗體復合物，X線片顯影并定影，所有雜交信號經成像分析儀系統測定條帶密度進行定量分析，以目的蛋白灰度值與內參β-actin的比值表示蛋白的表達水平。
1.7 統計學分析
采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，獨立樣本t檢驗進行兩組間比較，P<0.05為有統計學差異。
2 結果
2.1 成骨細胞的分離培養及純化
種植體周圍炎來源的成骨細胞與正常組織來源的成骨細胞在培養過程中狀態基本相同，10～14 d時從組織塊中爬出，形狀多為不規則形和三角形（圖1）。反復貼壁法純化成骨細胞貼壁后，2種來源的細胞在形態學上無明顯差異，細胞均呈長梭形和多邊形，胞核可見多核仁，呈圓形或橢圓形（圖2）。
2.2 堿性磷酸酶鑒定染色
細胞固定后按堿性磷酸酶活性檢測試劑盒要求進行檢測，可見藍黑色顆粒沉積在胞漿堿性磷酸酶活性部位（圖3）。2種來源細胞都表現出了堿性磷酸酶陽性，但正常組織來源的成骨細胞比種植體周圍炎來源成骨細胞內可見更多染色顆粒。
2.3 2種來源的成骨細胞增殖能力的比較
MTT檢測結果（圖4）表明，正常組織來源與種植體周圍炎來源的成骨細胞都表現出了一定的體外擴增能力，從第4天起2種來源細胞的增殖能力出現統計學差異（P<0.05），種植體周圍炎來源的成骨細胞的增殖活力明顯低于正常組織來源的成骨細胞。
2.5 2種來源的成骨細胞相關蛋白的比較
Western blot檢測結果表明，培養7 d時，與正常組織來源的成骨細胞相比，種植體周圍炎來源的成骨細胞OCN的表達降低，相對灰度值分析表明種植體周圍炎來源的成骨細胞OCN的表達水平約為正常組織來源的1/3（P<0.05）（圖6）。
3 討論
骨結合是牙種植手術的基礎。種植體與頜骨骨性結合面的形成與種植區的骨密度密切相關，骨密度越高，種植體與骨的結合率就越高[4]。種植體周圍炎正是在炎性微環境下，破壞了種植體與頜骨的骨結合，從而使種植體周圍支撐骨組織的功能喪失。成骨細胞在骨組織的修復和改建中起到重要作用，是維持骨組織新陳代謝[專業提供寫作論文和論文寫作服務，歡迎您的光臨dylw.net]的主要細胞；因此，研究炎癥組織來源的成骨細胞很有意義。
本研究從種植體周圍炎種植體脫落患者的頜骨骨組織中分離培養獲得了炎癥組織來源的成骨細胞，通過比較炎癥組織來源的成骨細胞和正常組織來源的成骨細胞的增殖能力以及相關骨組織修復基因的表達等生物學功能變化，探討炎性微環境對成骨細胞生物學功能的影響。
本實驗選用的成骨細胞均為第4代以內的細胞，結果表明，炎癥組織來源的細胞在體外培養后仍然具有一定的炎癥組織來源特異性。炎性細胞因子和種植體周圍炎致病菌的毒力因子會導致成骨細胞的增殖能力顯著 下降。本研究結果顯示，種植體周圍炎來源的成骨細胞雖然在形態學上并沒有表現出和正常組織來源的成骨細胞有明顯差異，但是在細胞增殖活力方面表現出了不同，種植體周圍炎來源的成骨細胞的增殖活力整體低于正常組織來源的成骨細胞。筆者認為這是由于種植體周圍炎的炎性微環境抑制了成骨細胞的增殖能力。
Runx2和Col Ⅰ是反應成骨細胞分化能力的重要指標，Runx2是成骨細胞分化的關鍵轉錄因子，在骨組織的形成與重建過程中具有重要的作用[5]。炎性因子會影響Runx2的表達從而抑制成骨細胞的分化能力[6-7]。Col Ⅰ是成骨細胞分化成骨的重要基質。研究[8]表明，種植體周圍炎的齦溝液中Col Ⅰ水平下降。本研究結果顯示，種植體周圍炎來源的成骨細胞的Runx2和Col Ⅰ表達水平相比正常組織來源顯著下降，表明炎性微環境可影響成骨細胞的成骨分化能力，抑制Runx2和Col Ⅰ的正常表達，這與Liu等[9]對干細胞的研究結果一致。
OCN與成骨細胞的礦化緊密相關，在一定程度上反應了成骨細胞礦化的能力。學者[10]研究證實炎性微環境會降低[專業提供寫作論文和論文寫作服務，歡迎您的光臨dylw.net]OCN的表達。本研究中，種植體周圍炎來源的成骨細胞由于在炎性微環境下降低了OCN mRNA的表達，從而導致OCN蛋白水平也明顯降低?？梢娧仔晕h境抑制了成骨細胞礦化的能力。
炎性微環境下成骨細胞的生物學功能受多方面調控，通過對比種植體周圍炎來源的成骨細胞和正常組織來源的成骨細胞的生物學功能變化，可以確定炎性微環境下成骨細胞的生物學功能受到影響，成骨分化及礦化能力顯著降低，這是種植體周圍骨組織吸收的重要原因。其具體機制尚需進一步的深入研究。
[關鍵詞]涉外警務專業學生 出入境管理工作 情報信息應用能力 培養
伴隨著21世紀的到來， 世界范圍內的科技革命突飛猛進，數字化、智能化、網絡化等各種高新技術正向各個領域全方位滲透，警務方式也發生了革命性的變革，情報主導警務模式便成為當前警務工作方式的主流。面對新型警務模式的建立，出入境管理部門必須主動適應信息化社會的客觀要求，牢固樹立情報信息主導警務的觀念，切實增強出入境情報信息管理工作的針對性、有效性和預見性，推動出入境管理工作的全面和可持續發展。
一、加強涉外警務專業學生情報信息應用能力的培養是為從事出入境管理工作墊定基礎。
（一）情報信息的應用是出入境管理工作中的中端業務。
出入境管理部門作為一個涉外的、公開實施行政管理的部門， 主要是代表國家行使出入境管理職能， 不僅其自身業務的發展和提高離不開情報信息工作， 而且出入境管理部門還必須通過開展和加強情報信息工作，為建設公安信息化隊伍的整體工作服務。
（二）當前出入境管理工作中情報信息應用存在的問題。
1.出入境管理部門中公安民警的情報素質相對較低具體表現在以下幾個方面：（1）公安民警對出入境情報信息收集工作的認識不夠， 在思想上還停留在單純以上報數量或獲取名次來衡量工作成績的傾向。（2）公安民警發現情報信息的敏感性不足，缺乏一名合格情報人員對情報信息所應具有的職業敏感性。（3）公安民警收集情報信息的方法不得當，對于情報信息的收集僅僅停留在直接獲取的層次，而對于間接收集情報信息的方法沒有做深入研究。
2.情報信息在出入境管理工作中沒有得到全面發揮。由于出入境管理部門中公安民警的情報素質相對較低，對于公安情報信息系統的使用也不夠熟悉，一些建立得較為完善的信息系統，大多還停留在資料庫、數據庫的利用上，只發揮出有限的查詢功能，系統更高級的功能沒有得到發揮。這是致使情報信息在出入境管理工作中沒有得到全面發揮的主要原因。
3.出入境管理部門的公安民警在情報信息應用方面的培訓與實戰脫軌。出入境管理部門十分重視情報信息在其工作的重要作用，也經常給內部民警做業務培訓。問題的關鍵是培訓的內容針對性不強，只是圍繞公安系統的大框架介紹情報信息的應用，而沒有針對出入境管理工作中情報信息的應用展開分析。導致公安民警所學知識與實戰脫軌，無法適應實戰。
（三）加強涉外警務專業學生情報信息應用能力的重要性。
當前，出入境管理部門情報信息工作面臨的嚴峻形勢要求公安院校必須加強涉外警務專業學生情報信息工作能力的培養。作為涉外警務專業學生，我們肩負著維護祖國出入境管理秩序，保衛祖國邊防安寧的神圣使命，因此必須要樹立正確的世界觀、價值觀、人生觀，努力提升自己，以適應社會的需求，適應出入境管理工作對出入境人才的需求。
二、涉外警務專業學生在出入境管理工作中情報信息應用能力的培養目標。
（一）培養學生學習情報信息的積極興趣。
1.大力給學生貫徹情報主導警務的理念，讓學生認識到情報信息應用能力在出入境管理工作中的重要意義。教師在平日的教學中要讓學生認識到情報信息是出入境管理工作的生命線，是科學決策的基礎，及時、準確、適用的情報信息是出入境管理部門克敵制勝的法寶。當情報主導警務的理念深入學生心中時，他們學習情報信息的興趣也會有很大的提高。“良好的開端是成功的一半”，只要激發出了學生學習情報信息的興趣，就能將他們培養出他們在出入境管理工作中情報信息應用能力。
2.促成學生研究情報信息知識的主觀能動性，讓學生形成主動在出入境管理工作中應用情報信息的潛意識。學習情報信息知識的特點在于易學難精，所以對學生而言，只有學習情報信息知識的一腔熱血是遠遠不夠的，最重要的是要有研究情報信息知識的主觀能動性。自覺地在情報信息知識的領域內鉆研，領會情報信息知識的精華所在，自如的將情報信息應用到出入境管理中去，形成一種在出入境管理工作中應用情報信息的潛意識，提升自身在出入境管理工作中情報信息應用的能力。
（二）培養學生在出入境管理工作中情報信息的收集能力和判斷能力。
1.提醒學生多留意出入境管理各方面的信息資源，讓學生養成積極捕捉情報信息的好習慣?！胺彩骂A則立，不預則廢”，情報信息工作能力的形成是一個漫長而艱巨的過程，在這期間需要大量的情報信息的積累。因此教師在平日的學習生活中要提醒學生多留意出入境管理各方面的信息資源，讓學生養成積極捕捉情報信息的好習慣?！笆朗露疵鹘閷W問，人情練達介文章”，通過大量信息情報的積累，學生的思維無意識就會向情報信息方面靠攏。當這種思維過程已經成為習慣性模式嵌入意識深處，變為一種自覺心理傾向，情報意識也就形成了。
2.增強學生對出入境情報信息的職業敏感性，讓學生形成敏銳的情報判斷能力。出入境情報信息工作做為一項特殊行業的工作，欲將其做好，必須增強對情報信息的職業敏感性，形成敏銳的情報判斷能力。對于情報判斷能力的提高需從兩個方面著手：一是對相關信息進行初步的分析研判， 防止大量信息垃圾的污染， 提高情報的收集效率。二是對情報進行系統的分析， 各方面信息綜合考慮， 相互比對、印證， 這樣能夠保證情報分析研判工作的準確性， 實現情報的優勢。
（三）培養學生出入境管理工作中情報信息應用的創造性。
1.豐富學生在出入境情報信息方面的知識，讓學生在出入境情報信息方面的思維得到擴展。情報信息方面的知識不是一成不變的，是不斷更新的，其更新周期的不斷縮短就要求我們不斷更新知識。教師應著力豐富學生在出入境情報信息方面的知識，增強學生出入境情報信息知識需求意識，提高他們的檢索技能，通過大量的出入境情報信息知識的積累，使學生在出入境情報信息方面的思維得到擴展。
2.肯定學生在出入境情報信息領域內的想象力，讓學生在出入境情報信息應用之中添加自己的創新之處。出入境情報領域是一個沒有邊界的領域，在沒有邊界的學科研究中就不能否認學生獨到的見解之處。就出入境情報信息應用而言，學生往往會想出很多新的方法將情報信息更好的銜接在出入境管理工作之中。此時，作為教師就應該肯定學生在出入境情報信息領域的想象力，讓其在以后的工作中發揮更大的創造力。
三、涉外警務專業學生在出入境管理工作中情報信息應用能力的培養途徑。
（一）加強涉外警務系教師情報主導警務的理念，激發學生學習情報信息的興趣。
出入境情報信息工作是一項實踐性很強的工作，學生欲想了解其中的技巧性，僅僅通過聆聽缺乏實戰經驗的教師講述理論知識是遠遠不夠的。因此公安院校必須邀請長期從事出入境情報信息工作的民警來學校給教師和學生授課、作講座，介紹出入境管理中情報信息工作的經驗與做法。同時選派涉外警務系的教師到出入境管理部門掛職鍛煉，增強出入境情報信息工作實踐經驗，提升教師隊伍的素質和授課水平。教師要積極關注國內外有關出入境情報信息工作的最新動態，了解出入境管理工作中情報信息應用的最新方法，及時傳遞給學生，活躍學生思維，激發他們學習情報信息的興趣，培養他們出入境情報信息應用意識，提高他們在出入境管理工作中情報信息應用的能力。
（二）加強學生在出入境管理工作中情報信息實際應用能力，讓其在實踐工作之中提升自身情報信息的收集能力和判斷能力。
出入境信息工作極具實踐性的特性要求學生必須具有實際應用能力。教育與實踐相結合是提高情報信息應用能力的根本方法，因此校方應該加強學生在出入境管理工作中情報信息實際應用能力，盡可能多的讓學生到出入境管理部門進行實習工作，更多的接觸出入境管理工作中情報信息方面的知識。學生要積極利用見習和實習的機會，把在學校所學的有關出入境情報信息工作的理論運用到實際出入境管理工作中，在實踐工作中提升自身情報信息的收集能力和判斷能力。
（三）拓寬學生在出入境情報信息領域之中的知識面，努力開發其在出入境情報信息應用之中的創新潛能。
出入境情報信息領域所涉及的知識十分廣闊，并且知識的更新周期也日漸縮短。因此教師應該盡可能多收集國內外有關情報信息的書籍，開拓情報信息工作的思路。同時應該通過講座、培訓的形式給學生講授與出入境情報信息有關聯的學科的基礎知識，特別要重點講授手工檢索、國際聯機檢索等知識，使學生盡早掌握常用的中外檢索工具的使用方法，接觸到出入境情報信息領域內的更多更新的知識。學生通過研究出入境情報信息方面的知識，得出自己在出入境情報信息工作上的獨到見解，努力開發自身在出入境情報信息應用中的創新潛能。
四、結語
總而言之， 在情報主導出入境管理工作的體系下公安教育也應與時俱進， 注重涉外警務專業學生在出入境管理工作中情報信息應用能力的培養，使學生畢業后適應情報主導出入境管理體系下的工作要求，推進出入境管理工作信息化的建設。
參考文獻：
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【摘要】 目的：嘗試構建基于脂肪干細胞、I型膠原凝膠以及PLGAβTCP支架的新型仿生骨組織工程復合體，并對其生物學性能進行研究. 方法：取3 mo齡日本大耳白兔皮下脂肪，獲得脂肪干細胞，經體外成骨誘導分化鑒定后使用I型膠原凝膠將其懸浮并與三維多孔支架PLGAβTCP復合，從而構建成脂肪干細胞I型膠原凝膠/PLGAβTCP骨組織工程復合體，體外成骨誘導培養2 wk，實驗以脂肪干細胞/PLGAβTCP材料復合體作為對照. 掃描電鏡觀察復合情況，并對脂肪干細胞的增殖以及成骨誘導分化情況進行檢測. 結果：I型膠原凝膠將rADSCs均勻懸浮于材料孔隙中，堿性磷酸酶活性以及細胞外基質礦化程度檢測顯示I型膠原凝膠能顯著促進rADSCs的成骨分化. 結論：脂肪干細胞I型膠原凝膠/PLGAβTCP復合體的構建成功為骨組織工程復合體的設計提供了一條新的思路.
【關鍵詞】 脂肪干細胞； I型膠原凝膠； PLGAβTCP支架； 骨組織工程
【Abstract】 AIM: To fabricate a novel bone tissue engineering construct using collagen I gel to suspend adiposederived stem cells (ADSCs) into a porous PLGAβTCP scaffold (rADSCsCOL/PLGAβTCP) and explore its potentiality for bone tissue engineering. METHODS: ADSCs were prepared by collagenase I digestion of subcutaneous fat from the suprascapular site of Japanese white rabbit. Firstly， the osteogenic differentiation of rabbit ADSCs (rADSCs) was identified by von Kossa staining after in vitro culture for 4 weeks under osteogenic medium. Then the rADSCsCOL/PLGAβTCP composite was fabricated using collagen I gel to suspend rADSCs into PLGAβTCP scaffold and cultured under osteogenic medium for 2 weeks. Meanwhile， the single combination of rADSCs and PLGAβTCP scaffold was also prepared as control. Morphological observations were carried out using scanning electron microscopy (SEM). Cell proliferation， alkaline phosphatase activity and calcium deposit were also determined to fully evaluate the osteogenic differentiation of rADSCs in both composites. RESULTS: By presuspended in collagen I gel， the rADSCs were evenly distributed in the pores of the PLGAβTCP scaffold. Furthermore， collagen I gel remarkably promoted the osteogenic differentiation of rADSCs in PLGAβTCP scaffold. CONCLUSION: The successful fabrication of rADSCsCOL/PLGAβTCP composite casts a new light on the construction of bone tissue engineering composites.
【Keywords】 adiposederived stem cells; collagen I gel; PLGAβTCP; bone tissue engineering
0 引言
生物支架材料是骨組織工程研究中的一個重要環節［1］. 目前常用的生物材料例如高分子聚合物、生物陶瓷等，在與種子細胞復合過程中僅僅能夠起到機械性支架作用，而缺乏生物活性，在與種子細胞復合以后，難以與其形成良好互動，對其進一步的增殖、成骨分化施加積極影響. 而I型膠原作為骨組織中主要的有機成分，在骨形成過程以及維持正常骨結構中發揮了重要作用［2］. 為此，我們從仿生學角度考慮，初步嘗試利用I型膠原凝膠懸浮脂肪干細胞（adiposederived stem cells， ADSCs）與三維多孔支架PLGAβTCP復合構建一種新型仿生骨組織工程復合體，并對其生物學性能進行研究，以探討將其應用于骨缺損修復的可行性.
1 材料和方法
1.1 材料 3 mo齡成年日本大耳白兔，由第四軍醫大學實驗動物中心提供；DMEM培養基、地塞米松、抗壞血酸、β甘油磷酸鈉、Ⅰ型膠原酶、磷酸對硝基苯酚（PNPP）、對硝基苯酚（PNP）均購自SIGMA公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；堿性磷酸酶檢測試劑盒購自上海仁寶試劑公司；細胞外鈣定量檢測試劑盒（Calcium C kit， WAKO Pure Chemical Industries）.
1.2 方法
1.2.1 兔ADSCs（rabbit ADSCs， rADSCs）的原代培養 3 mo齡成年日本大耳白兔，耳緣靜脈注射空氣處死. 常規備皮，消毒，取其頸背部皮下脂肪. 分離肉眼可見的筋膜、血管，無菌PBS沖洗3遍，眼科剪將組織剪成1～2 mm3組織塊，置于1.5 g/L Ⅰ型膠原酶中于37℃消化1 h. 100目篩網過濾后900 r/min離心10 min，用普通培養液（含100 mL/L胎牛血清的DMEM）重新懸浮、接種. 待細胞達90％匯合時用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代.
1.2.2 rADSCs的成骨誘導分化鑒定 采用第3代rADSCs，以105個/孔接種于6孔板，待其完全貼壁后于普通培養液中加入10-7 mol/L地塞米松、抗壞血酸50 mg/L和10 mmol/L β甘油磷酸鈉進行成骨誘導，4 wk后采用馮庫薩（von Kossa）鈣染色法檢測誘導分化情況.
1.2.3 PLGAβTCP支架的制備 由清華大學激光快速成型中心將聚乳酸聚乙醇酸（PLGA）［polylactide (50%)coglycolide (50%)］與β磷酸三鈣（βTCP）按照7∶3，W/W的比例經快速成型技術低溫沉積工藝制成［3］，具有良好的孔隙率（>90 %）以及孔徑（300 ～350 μm）.
1.2.4 I型膠原凝膠溶液的制備 將I型膠原用100 mL/L，V/V醋酸溶解并定容至50 mg/L，然后將其以10∶1∶1的比例與10×的DMEM及胎牛血清混合，最后使用1 mol/L NaOH調整溶液pH至7.4. Co60消毒滅菌，置于4℃備用.
1.2.5 rADSCsI型膠原凝膠/PLGAβTCP骨組織工程復合體的構建（rADSCsCOL/PLGAβTCP） 使用第3代rADSCs，待其達100％匯合后2.5 g/L胰蛋白酶消化、離心，于冰浴條件下使用100 μL I型膠原凝膠溶液以2×109個/L的密度懸浮細胞并均勻滴加于PLGAβTCP支架材料孔隙中，37℃作用0.5 h以使膠原凝膠溶液凝結. 最后加入成骨誘導培養液于37℃ 50 mL/L CO2條件下進行成骨誘導培養. 同時設立無細胞I型膠原凝膠/PLGAβTCP復合體作為對照（COL/PLGAβTCP）.
1.2.6 rADSCs/PLGAβTCP骨組織工程復合體的構建（rADSCs/PLGAβTCP） 使用第3代rADSCs，待其達100％匯合后2.5 g/L胰蛋白酶消化、離心，以2×109個/ L的密度懸浮細胞. 取100 μL細胞懸液均勻接種于預處理的PLGAβTCP支架中. 于37℃ 50 mL/L CO2條件下共培養4 h，使細胞與材料充分復合. 最后加入成骨誘導培養液進行培養. 同時設立空白PLGAβTCP支架材料作為對照.
1.2.7 材料中細胞增殖檢測 于接種后4 h和第1，3，7，10，14 d進行細胞增殖測定. rADSCsCOL/PLGAβTCP復合體組：將培養液吸除后加入20 g/L的I型膠原酶于37℃條件下作用45 min以徹底分解I型膠原纖維，等量培養液中和后將細胞懸液吸出并于1200 r/min離心10 min. rADSCs/PLGAβTCP復合體組：將培養液吸出后加入2.5 g/L胰蛋白酶消化5 min，等量培養液中和，900 r/min離心9 min. 最后將細胞團塊重新懸浮于培養液中進行細胞計數并計算初始細胞接種密度（復合細胞數量/總細胞數量）（每組每個時間點共有4例標本）.
1.2.8 堿性磷酸酶活性檢測 采用PNPP法. 步驟：于誘導培養第7和14日，收集rADSCsCOL/PLGAβTCP和rADSCs/PLGAβTCP復合體細胞（實驗方法同1.2.7）. 將兩組細胞經超聲裂解后，加入PNPP于37℃反應30 min，0.1 mol/L NaOH中止反應. 于405 nm處讀取A值. 參照總蛋白定量以及預先繪制的PNP標準曲線，將堿性磷酸酶活性單位定義為每分鐘每微克總蛋白中所含PNP納摩爾數（nmol PNP/μg protein/min）（每組每個時間點共有4例標本）.
1.2.9 細胞外基質礦化程度檢測 采用OCPC法. 于誘導培養第7和14日，收集rADSCsCOL/PLGAβTCP以及rADSCs/PLGAβTCP復合體細胞（方法同1.2.7），加入0.5 mol/L HCl于常溫下過夜，將細胞外不溶性鈣鹽分解成可溶性鈣離子，實驗操作按照Calcium C Kit說明書進行. 鈣離子濃度以μg/105個細胞表示（每組每個時間點共有4例標本）.
1.2.10 形態學觀察 在誘導培養2 wk后，將各組復合體取出，進行掃描電鏡觀察. 實驗步驟：無菌PBS沖洗3遍，2.5 g/L戊二醛固定，逐級梯度酒精脫水，臨界點干燥. 經表面噴金后置于鏡下觀察.
統計學處理： 所有計數資料均采用x±s表示，采用SPSS 11.0 軟件進行配對t檢驗， P
2 結果
2.1 rADSCs的體外培養及成骨誘導分化鑒定 于體外培養條件下，原代培養rADSCs呈成纖維細胞樣，傳代后細胞形態變化不大，仍呈梭形、三角形，增殖能力旺盛. 連續培養至第15代仍保持良好的細胞形態與增殖能力（圖1A）. 換用成骨誘導液干預4 wk后經von Kossa染色可見細胞及其周圍附著的鈣鹽與硝酸銀發生置換反應而被染成黑色，說明此時細胞外基質礦化，成骨分化基本完成（圖1B）.
A：原代培養rADSCs 相差 ×100；
B：von Kossa染色 相差 ×200.
圖1 體外培養兔ADSCs細胞（略）
2.2 材料中的細胞增殖情況 rADSCsCOL/PLGAβTCP復合體組的初始細胞接種密度為(97.20±2.30)%，而rADSCs/PLGAβTCP復合體組僅為(36.50±3.80)%，前者顯著高于后者（n=4，P
2.3 堿性磷酸酶活性定量檢測 誘導培養1 wk后，rADSCsCOL/PLGAβTCP復合體組堿性磷酸酶活性為(0.27±0.02) nmol PNP/μg protein/min， 而rADSCs/PLGAβTCP復合體組為(0.14±0.02) nmol PNP/μg protein/min，前者顯著高于后者；誘導培養2 wk后rADSCsCOL/PLGAβTCP復合體組堿性磷酸酶活性則高達(0.85±0.27) nmol PNP/μg protein/min，顯著高于rADSCs/PLGAβTCP復合體組(0.51±0.14) nmol PNP/μg protein/min，兩組差異具有統計學意義（n= 4， P
2.4 細胞外基質礦化程度檢測 誘導培養1 wk后，rADSCsCOL/PLGAβTCP復合體組細胞外基質礦化程度［(23.69±3.50) μg/105個細胞］與rADSCs/PLGAβTCP復合體組［(20.90±1.68) μg/105個細胞］差異無統計學意義（n= 4， P>0.05）；而2 wk后前者［(71.88±2.89) μg/105個細胞］則顯著高于后者［(48.10±2.77) μg/105個細胞］（n=4， P
2.5 形態學觀察 掃描電鏡顯示，PLGAβTCP支架材料為規則的相互交通的多孔狀三維立體結構（圖2A），而對于無細胞COL/PLGAβTCP復合體組，可以看到I型膠原纖維均勻分布于材料表面及孔隙中（圖2B）. 在rADSCs/PLGAβTCP復合體組中，rADSCs僅貼附于材料表面，孔隙中沒有細胞長入(圖2C). 然而在rADSCsCOL/PLGAβTCP復合體組中，材料孔隙被懸浮于膠原凝膠中的rADSCs所完全充填(圖2D). 復合細胞共培養2 wk后，rADSCsCOL/PLGAβTCP和rADSCs/PLGAβTCP復合體組中的rADSCs在材料孔隙中均呈成纖維細胞樣生長(圖2E，F).
A: PLGAβTCP支架材料（：材料的小梁， ：材料的孔隙） ×60；B: COL/PLGAβTCP復合體 ×70；C: rADSCs/PLGAβTCP復合體 ×50；D: rADSCsCOL/PLGAβTCP復合體 ×50；E: 為C圖白框的放大，rADSCs貼附于材料表面呈復層生長（: rADSCs） ×300；F: 為D圖白框的放大，rADSCs填滿材料的孔隙（: I型膠原凝膠經掃描電鏡樣品處理程序處理后所形成的膠原顆粒， : rADSCs） ×200.
圖2 掃描電鏡觀察（略）
3 討論
在骨組織工程復合體的構建過程中，三維多孔支架材料所具有的孔隙率以及孔徑大小具有重要意義. Karageorgiou等［4］報道的當支架材料具有良好的孔隙率以及孔徑大于300 μm時，在體內能夠明顯促進新生骨組織形成以及新生血管長入，從而能夠在骨缺損修復過程中發揮重要作用. 然而，良好的孔隙率以及孔徑往往會導致種子細胞在與材料復合時的大量丟失. 本研究采用具有良好的骨缺損修復能力的PLGAβTCP 作為支架材料［3，5］. 實驗結果顯示直接將rADSCs滴加于PLGAβTCP材料時，僅有一少部分細胞成功與材料復合，大部分細胞由于材料的孔隙率而丟失. 因此，具有良好的孔隙率以及孔徑的支架材料雖然具有良好的骨傳導性，但是由于其表面積相對有限，采用傳統直接滴加細胞的接種方式并不能夠促成細胞在材料孔隙中的均勻分布.
為了解決這個問題，在本實驗中I型膠原凝膠被用來實現脂肪干細胞與材料的均質復合. I型膠原凝膠作為水凝膠類支架的一種，其所具有的半固體、半液態的特點使其不僅能夠相對容易的實現細胞的均勻分布，而且能夠通過物理性捕獲效應將大量細胞限制于其中，一方面解決了細胞與材料的復合問題，另一方面也解決了在接種過程中細胞的丟失問題. 此外，作為正常骨組織結構中主要的有機成分， I型膠原能夠調控細胞黏附［6］，促進成骨細胞的增殖［7］、分化并能夠引導骨組織再生［8］. 因此，在本實驗中我們使用PLGAβTCP多孔支架、rADSCs以及I型膠原凝膠來構建了一種新型仿生骨組織工程復合體. 實驗結果顯示I型膠原凝膠能夠顯著促進復合體中rADSCs的堿性磷酸酶活性以及細胞外基質礦化程度（rADSCsCOL/PLGAβTCP復合體組＞rADSCs/PLGAβTCP復合體組，P
綜上所述，我們通過將rADSCs懸浮于I膠原凝膠后再與PLGAβTCP支架復合構建了一種新型仿生骨組織工程復合體（rADSCsCOL/PLGAβTCP），與傳統直接滴加細胞接種方式所構建的復合體相比（rADSCs/PLGAβTCP），本研究采用的構建方法材料孔隙中的rADSCs分布均勻且密度高，進一步體外成骨誘導分化相關檢測顯示I膠原凝膠能夠顯著促進rADSCs在材料中的成骨分化，為骨組織工程復合體的構建提供了新的思路.
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1.高中生物15個核心概念
這些概念從小到大的排列順序是：脫氧核糖；脫氧核苷酸；基因；DNA；染色質；真核細胞；細胞，屬于微觀方面。組織；器官；系統；個體；群落；種群；生態系統；生物圈，屬于宏觀方面?，F做如下說明。
1.1微觀方面
1.1.1脫氧核糖：一種單糖，由C、H、O三種元素組成，是組成脫氧核苷酸的成分。
結構式
1.1.2脫氧核苷酸：是組成DNA的基本單位，由C、H、O、N、P五種元素組成，每一個脫氧核苷酸分子有一份子的脫氧核糖、一份子含氮堿基和一份子磷酸組成，脫氧核糖核苷酸的堿基有：腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）。根據所含堿基的不同，分為腺嘌呤脫氧核苷酸、鳥嘌呤脫氧核苷酸、胸腺嘧啶脫氧核苷酸、胞嘧啶脫氧核苷酸四種。脫氧核糖核酸（DNA）是由四種脫氧核苷酸通過化學鍵組成的雙螺旋結構，就是通常意義上的DNA。其結構式如下：
1.1.3基因：是具有遺傳效應的DNA的片段，其基本組成單位是四種脫氧核苷酸，一個DNA上有許多基因。編碼蛋白質或RNA等具有特定功能產物的遺傳信息的基本單位，是染色體或基因組的一段DNA序列，包括編碼區（外顯子）、編碼區前后對于基因表達具有調控功能的序列和單個編碼序列間的間隔序列（內含子）。
1.1.4DNA：主要由4種脫氧核糖核苷酸按一定的順序，以3′，5′―磷酸二酯鍵連接而成的一類核酸，是生物遺傳信息的載體。主要存在于細胞核中，少數存在于細胞質中，是大多數生物的遺傳物質。一個DNA上有許多基因，DNA和蛋白質結合成為染色質或染色體。它們的組成和排列不同，顯示不同的生物功能，如編碼功能、復制和轉錄的調控功能等。排列的變異可能產生一系列疾病。
1.1.5染色質：由DNA和蛋白質組成，存在于真核細胞的細胞核中，易被堿性染料染成深色的物質。染色質的基本化學成分為脫氧核糖核酸白，它是由DNA、組蛋白、非組蛋白和少量RNA組成的復合物。
1.1.6真核細胞：具有核膜包裹的成型細胞核的細胞，細胞核中含染色質，細胞質中線粒體、高爾基體、內質網、核糖體等多種細胞器。真核細胞能進行有絲分裂，還能進行原生質流動和變形運動。在植物細胞中光合作用和呼吸作用分別在葉綠體和線粒體中進行。除細菌和藍藻植物的細胞以外，所有的動物細胞和植物細胞都屬于真核細胞，由真核細胞構成的生物稱為真核生物。
1.1.7細胞：是生物體結構和功能的基本單位，有原核細胞和真核細胞兩種。細胞是生命活動的基本單位。已知除病毒之外的所有生物均由細胞所組成，就是病毒生命活動也必須在細胞中才能體現。一般來說，細菌等絕大部分微生物及原生動物由一個細胞組成，即單細胞生物；高等植物與高等動物則是多細胞生物。世界上現存最大的細胞為鴕鳥的卵子。
1.2宏觀方面
1.2.1組織：由形態相似、結構、功能相同的細胞聯合在一起的細胞群，是細胞分化的結果。受精卵分裂產生的細胞開始在形態、結構和功能上是相同的，以后經過細胞的分化，逐漸形成各種不同的形態，具有不同的功能。它們進而形成不同的細胞群，就是組織。所以說，組織是細胞分化的結果。動物和人的組織有四大類：上皮組織、結締組織、肌肉組織和神經組織。
1.2.2器官：由不同的組織按照一定的次序結合在一起而構成的能行使一定功能的結構單位。如動物的心臟、肺、肝、腎等，植物的花、果實、種子、根、莖、葉等。器官是由多種組織構成器官是生物體中自己具有一定功能，承擔生物體一定的工作，是生物結構層次中比組織高一級的層次，器官由各種組織構成。植物的器官比較簡單，最高等的被子植物有根、莖、葉、花、果實、種子六大器官，而其他植物并不是都有這六大器官的。裸子植物有根、莖、葉、花、果實；蕨類植物有根、莖、葉。
1.2.3系統：能夠共同完成一種或幾種生理功能的多個器官，按照一定的次序組合而構成系統。如動物的神經系統、消化系統、循環系統等。
1.2.4個體：若干個器官和系統協同完成復雜生命活動的單個生物體為一個個體。單細胞生物的個體就是由一個細胞構成的生物體。個體能夠進行新陳代謝，實現自我更新，在新陳代謝的基礎上，表現出生長、發育、衰老、死亡，等等。
1.2.5種群：是指在一定時間內占據一定空間的同種生物的所有個體。種群中的個體并不是機械地集合在一起，而是彼此可以，并通過繁殖將各自的基因傳給后代。它是進化的基本單位，同一種群的所有生物共用一個基因庫。
1.2.6群落：把在一定生活環境中的所有生物種群的總和叫做生物群落，簡稱群落。組成群落的各種生物種群不是任意地拼湊在一起的，而有規律組合在一起才能形成一個穩定的群落。它們之間有各種直接和間接的關系。在群落中，一個種群的興衰、變化都會對其他種群產生各種各樣的影響。
1.2.7生態系統：在一點自然區域中，生物群落與它的無機環境相互作用而形成的統一整體。它是由生物群落與無機環境構成的，生態系統的范圍可大可小，相互交錯，最大的生態系統是生物圈，最為復雜的生態系統是熱帶雨林生態系統。它由無機環境因素和生物因素組成，無機因素包括陽光、水、空氣、溫度、無機鹽等，生物因素由生產者（綠色植物）、消費者（草食動物和肉食動物）、分解者（腐生微生物）三部分組成。它既有垂直結構又具有水平結構。
1.2.8生物圈：生物圈是指地球上凡是出現并感受到生命活動影響的地區，是地表生物體包括微生物及其自下而上環境的總稱，是地球特有的圈層。它也是人類誕生和生存的空間。生物圈是地球上最大的生態系統。它包括大氣圈的下層、巖石圈的上層、整個水圈和土壤圈全部。
2.細胞是核心概念的橋梁,是宏觀和微觀的分界線
在這些概念中，屬于生命系統層次的基本概念是：細胞組織器官系統個體種群群落生態系統生物圈，其中細胞是微觀系統和宏觀系統的分界線。
關鍵詞生物正交化學，代謝工程，生物標記，活體示蹤，藥物傳遞
生物正交化學（bioorthogonal chemistry）反應是指在不干擾機體正常生物過程的情況下，可以在生物體內進行的化學反應.這種化學反應即使在復雜的生理條件下也具有優良的選擇性，反應過程簡單快速并且不會受體內其他成分的影響，不會產生毒副產物，在生物醫學的研究中有著廣泛的應用前景［1-2］.該反應通過生物、化學反應將目的報告基團修飾到靶標物上，隨后與攜帶配對基團的標記物發生化學連接反應，從而實現標記物對靶標物的穩定偶聯［3-4］.目前廣泛使用的生物正交反應包括：金屬催化或光催化的生物正交反應以及無需催化的生物正交反應.銅催化的疊氮和末端炔基之間的環加成反應（copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC）是生命科學研究中常用的生物正交反應，但是銅離子對生物體具有毒性，不適宜廣泛應用.在此基礎上，Bertozzi等［5］于2004年開發了一種新型的無銅生物正交化學反應（strain-promoted azide-alkyne cycloaddition，SPAAC），該反應避免了銅作為催化劑所產生的細胞毒性，成功地將生物正交反應應用于活細胞（圖1）.常用的生物正交化學基團主要包括疊氮（N3）基團、二苯并環辛基（dibenzocyclooctyne，DBCO）、雙環［6.1.0］壬炔（bicyclo［6.1.0］nonyne，BCN）和雙苯并八元環炔（dibenzocyclooctyne，DIBO）等.其中，N3基團與炔基（DBCO，BCN）之間具有高度的反應活性.N3基團尺寸小，引入到活體系統中僅產生微小的結構擾動，不影響生物分子的功能，并且天然的生物體內不存在N3分子，因而不會與體內的生物分子反應，是一種理想的生物正交功能基團［6-7］.
為了在體內實現高效、特異的生物正交標記，首先需要將理想的正交反應基團（如疊氮基團）選擇性地引入到細胞或生物體的目標生物分子上，隨后利用配對基團修飾的標記物對目標生物分子進行選擇性連接.因此，如何安全、無損地將生物正交基團引入生物靶標物中仍然是一個亟待解決的問題.近年來，代謝工程（metabolic engineering）作為一種無損、高效的活體修飾技術，可利用生物體固有的代謝合成途徑將功能基團引入到活體系統中［8-11］.這是由于生物體在代謝過程中需要利用氨基酸、糖類或脂類等生物成分，通過將功能基團修飾到糖類或脂類等生物分子中，便可通過固有的生物合成途徑在體外或體內直接將功能基團修飾到活細胞或活體生物中.基于代謝工程與生物正交化學的標記技術，通過在活細胞或整個生物體中引入特定的生物正交化學基團，隨后與配對基團修飾的探針或納米藥物通過生物正交化學反應連接，可以實現對目標分子或生物體的特定標記、細胞或病原微生物的成像示蹤、藥物的靶向遞送等（圖2）［6］.該技術通過細胞內源性代謝過程而快速形成穩定的共價連接，而且不受外源化學反應干擾，因此具有無損、高效、穩定、特異的優點，并成為研究者關注的焦點.本文主要從以下幾個方面闡述生物正交化學在活體系統中應用的最新研究進展.
1生物正交化學在活體標記與示蹤中的應用
為了了解細胞或病原微生物等活體系統的生物學機制，對目標生物分子在體內進行特定的標記和追蹤是重要的研究手段.目前常用較為成熟的生物標記技術，包括熒光蛋白基因編碼和熒光染料抗體偶聯.綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因編碼標記常用于蛋白質的功能研究，分析活細胞和整個機體中的蛋白質表達和定位，但是此類較大的基因編碼標記物會對蛋白質的結構產生擾動，從而影響相關蛋白質的表達或功能，而且這種基因標記方法不適用于細胞中的聚糖、脂類、核酸等生物分子［1，7，12］.另外，雖然熒光染料抗體偶聯物也已廣泛應用于跟蹤活細胞和整個機體的生物分子，適用于多種生物分子的成像，但是這些偶聯試劑的大尺寸和物理性質阻礙了它們在活體系統中結合抗原，從而限制了其在生物體內的應用［1，6］.因此，尋找一個能在活體內廣泛適用且對生物體幾乎沒有影響的標記技術，對于活體生物的功能研究具有極其重要意義.近年來，科學家們發展了基于代謝工程的生物正交化學修飾策略，該策略利用生物自身的生物合成和代謝機制，將獨特的功能基團（生物正交化學功能基團）整合到目標生物分子中，從而實現在復雜的生物體內對目標分子的標記和研究.
1.1細胞的生物正交代謝標記
在活細胞中，蛋白質、糖類和脂質都可以被生物正交基團修飾［7，13］.通過化學合成的方法將生物正交基團連接到代謝類似物上，利用生物的代謝合成過程將生物正交基團引入細胞，隨后用配對基團修飾的反應探針連接，可以實現對目標生物分子的標記或成像，進而分析細胞或目標生物分子的定位和重要功能.
科學家研究證實了代謝標記的生物正交基團能有效標記細胞，Bertozzi的團隊［14］利用糖代謝工程與生物正交反應，分析了活斑馬魚的胚胎發育過程中多種糖類結構.該團隊在斑馬魚胚胎發育過程中，在不同的細胞發展階段加入環辛炔功能化的唾液酸，使其作為一種糖類衍生物可以被細胞利用并將功能基團引入細胞表面的糖蛋白上，隨后與配對基團修飾的熒光探針通過生物正交反應連接，可視化地研究斑馬魚胚胎發展過程中糖類表達的動力學和定位.Rong等［15］使用N修飾的糖類似物在體內代謝標記大鼠的心臟聚糖，N3可與DBCO修飾的熒光探針反應，在活體心臟中可視化監控心肌細胞表面糖蛋白.此外，將心臟分離裂解后，與炔烴修飾的生物素反應，用鏈霉親和素珠富集后，進行了蛋白質組學的鑒定.這一研究在大鼠中實現了心臟聚糖的體內代謝標記和成像，有利于探索心臟糖基在病理生理過程中的生物合成和功能應用.Lee等［16］開發了一種簡單可控的干細胞成像方法，首先利用疊氮化的代謝前體Ac4ManNAz，通過糖代謝在干細胞表面引入N3基團作為外源性化學受體，隨后制備攜帶BCN基團的納米顆粒BCN-CNPs，將Cy5.5熒光染料、氧化鐵納米粒子和金納米粒子分別偶聯或包封在BCN-CNPs上，用于光學、磁共振和計算機斷層掃描成像.這些可成像的納米粒子通過生物正交反應結合在干細胞表面上的化學受體，實現對干細胞的體內追蹤.
1.2病原微生物的生物正交標記與示蹤
細菌和病毒等病原微生物嚴重威脅著人類的生命健康，探索病原微生物在活體內的侵襲行為和相關機制顯得尤為重要.利用代謝工程和生物正交反應，可以實現對病原微生物的活體示蹤，有利于研究其致病機制.細菌多糖具有獨特的結構，多與發病機制有關，是廣泛研究的靶點.通過代謝工程和生物正交化學對細菌多糖進行標記，能夠可視化地研究細菌的體內侵襲行為［17］.Swarts等［18］設計了一系列含有N3基團的海藻糖類似物，分枝桿菌通過代謝合成途徑利用人工合成的海藻糖合成自身的細胞壁糖脂，從而在細菌表面引入N3基團.隨后與炔基功能化的熒光探針通過生物正交反應連接，用于后續糖脂分布、轉運和動力學成像以及代謝產物的分析和發現.Geva-Zatorsky等［19］利用糖代謝工程和生物正交化學對腸道的各種共生厭氧菌進行標記，可視化地研究了厭氧微生物在小鼠體內的分布和定位，以及微生物與宿主的相互作用.
病毒感染導致的疾病是對人類健康的一大威脅，了解病毒入侵的機制有助于我們更好地預防和治療病毒感染導致的疾?。?0-21］.通常使用基因工程技術使病毒表達熒光受體或者使用熒光試劑化學偶聯病毒，以實現對病毒的成像和跟蹤［20，22］.然而，這些標記技術容易影響病毒的侵襲能力，無法準確再現病毒在機體內的感染過程，不利于病毒入侵機制的研究.由于病毒的蛋白質和核酸等分子均可被標記，將代謝工程與生物正交化學結合，可實現對病毒的無損代謝修飾，最終實現對病毒的實時跟蹤或標記［23-24］.
病毒外部結構的組成部分，如病毒衣殼、囊膜等，是由糖類、蛋白質和脂質構成的，這些成分主要來源于宿主細胞.通過細胞的代謝過程，可在病毒進行復制與組裝時將攜帶功能基團的代謝衍生物嵌入到病毒的衣殼、囊膜等結構中.Pan等［25］提出的利用生物正交和脂類代謝標記技術追蹤病毒的策略，減少了化學標記對病毒的干擾，有效研究了病毒的體內感染過程.通過將疊氮化物修飾的脂類代謝標記到H5N1p病毒包膜上，利用DBCO修飾的近紅外熒光探針通過生物正交反應偶聯小鼠肺部的病毒，實現了體內的病毒成像和追蹤.
2生物正交化學在靶向傳遞中的應用
通過代謝工程，生物正交化學基團可以被修飾到細胞或病原微生物的表面，以此構建人工靶點.將其應用于藥物的靶向傳遞時，能顯著提高藥物的生物利用率，從而降低藥物的毒副作用.在納米材料的發展過程中，生物配體例如抗體、多肽、適配體等通常被連接到納米材料表面用于增加與特定細胞系的結合，從而實現藥物的靶向遞送［26-28］.然而，這種傳統的靶向修飾策略會增加納米顆粒制備的復雜性，給生物應用帶來潛在的風險［29-30］.近年來，基于代謝工程的生物正交化學標記作為一種有效的靶向修飾策略，被廣泛應用于藥物的靶向設計.
2.1抗腫瘤藥物的靶向遞送
傳統的靶向配體修飾策略已經被證明具有較好的腫瘤靶向效果，例如抗體偶聯藥物.然而，基于抗體的藥物傳遞系統存在一定的局限性，包括腫瘤的異質性以及由于長期化療或長期藥物暴露導致的癌細胞中抗原的下調，嚴重影響了抗腫瘤藥物的靶向應用［8，13］.代謝工程可以在包括腫瘤細胞在內的各種細胞表面，人工引入生物正交功能基團（如N3基團）作為化學受體，并且不受限于細胞的表型，這些人工化學受體可大量表達，用于生物正交標記、靶向識別和藥物遞送［8，31-32］.
目前，生物正交化學反應已被應用于成像劑和抗腫瘤藥物的組織靶向遞送，具有很好的體內示蹤和腫瘤靶向效果［33-34］.在癌癥治療中，體內可視化的成像劑遞送以及針對腫瘤組織的特異性藥物的遞送是非常有必要的.可視化有利于體內的腫瘤診斷，而高效特異的藥物傳遞可以提高藥物的治療效果，減少不良反應.基于糖代謝的生物正交化學使得生物體內靶向的藥物傳遞以及腫瘤的診斷治療獲得進一步的改善.Lee等［31］通過兩步體內腫瘤靶向策略實現了對腫瘤的高效特異性靶向.第一步通過小鼠尾靜脈注射包載了疊氮化糖Ac4ManNAz的納米顆粒，通過高滲透長滯留效應（enhanced permeability and retention effect，EPR）使其在腫瘤部位累積，并且通過細胞固有的生物代謝作用在腫瘤細胞引入N3基團.第二步尾靜脈注射包載了Ce6的BCN修飾的納米顆粒，通過體內生物正交反應使含藥納米顆粒靶向富集在腫瘤部位，顯著提高了對腫瘤的治療效果.Du等［35］首先給小鼠尾靜脈注射裝載了疊氮化糖衍生物的納米膠束（Ac4ManNAz-LP），使其依靠EPR效應累積在腫瘤部位并對腫瘤代謝修飾N3基團，隨后將制備的DBCO修飾的光敏劑納米顆粒（DBCO-ZnPc-LP）注射到小鼠體內，結果證明DBCO-ZnPc-LP通過生物正交反應能很好的累積在腫瘤部位，產生高效的光熱/光聲協同抗腫瘤效果.此外，我們課題組構建了一種雙靶向的仿生納米顆粒［36］，將N基團引入到T細胞表面作為人工靶點，提取細胞膜包裹于納米顆粒表面，利用T細胞膜的免疫識別功能以及N3基團與BCN基團之間的生物正交反應，實現了對腫瘤的高效靶向和光熱治療（圖3）.
2.2免疫治療中的靶向應用
免疫治療是腫瘤治療的有效方法之一，生物正交化學反應可用于免疫刺激物的傳遞，增強免疫治療抗腫瘤的效果.Zhang等［37］通過在磁性納米簇的表面包裹被N3工程化的白細胞膜，然后通過生物正交反應在細胞膜表面修飾T細胞刺激物，設計了一種人工抗原呈遞細胞（aAPCs）.制備的aAPCs可以刺激抗原特異性細胞毒性T細胞（CTL）的擴增，并且通過磁共振成像和磁控技術，可以直觀有效地引導CTL進入腫瘤組織，增強T細胞的抗腫瘤治療效果.Mongis等［38］將不同的免疫刺激物與DBCO基團進行偶聯，用疊氮化的糖預處理腫瘤細胞使其表達N3基團，隨后通過生物正交化學反應將免疫刺激物連接到腫瘤細胞表面，成功引入的免疫刺激物可以激活小鼠的抗腫瘤免疫作用，顯著抑制腫瘤的生長.
此外，生物正交化學在免疫治療中也發揮著很大的作用，具有很好的應用前景.我們課題組基于生物正交糖代謝構建了一類新型的非天然單糖類似物（Ac4ManN-BCN），并將其應用于T細胞的免疫治療研究.該單糖類似物高效地將化學報告基團BCN標記于腫瘤細胞表面，形成一種腫瘤表面的人工靶點，構建一種人工T細胞-腫瘤靶向策略.疊氮修飾后的T細胞（N3-T細胞）利用生物正交反應快速地靶向BCN標記的腫瘤細胞（BCN-tumor細胞），并促進T細胞的快速激活及其對腫瘤的識別殺傷作用［39］.同時，我們利用前期細胞糖代謝工程將化學報告基團（-N3）嵌入T細胞膜中，構建人源T細胞人工受體，病毒經納米材料（PEI-DBCO）包裹后，病毒粒子表面的DBCO基團與T細胞人工受體（-N3）發生高效、特異的生物正交反應，促進病毒與T細胞的相互作用與基因轉導，從而構建出安全、高效的CAR-T細胞，實現對腫瘤的免疫治療［40］（圖4）.
2.3抗菌藥物的靶向遞送
【關鍵詞】細胞膜的結構；細胞膜功能；合作探究；小組合作
我今天說課的內容是人教版必修一第三章第一節細胞膜的結構和功能。高中生物必修課本一共三冊書，必修一分子與細胞是其中的基礎，而必修一中細胞的結構和功能為基礎中的基礎，前面學習了構成生物體的物質基礎：元素和化合物，接下來又學習元素和化合物構成的結構基礎細胞。只有這部分知識的熟練掌握才能更好地理解和學習后面的細胞的增殖，分化，衰老，癌變；必修二的減數分裂；必修三的興奮地傳遞和激素的功能特點。同時高一的學生剛剛進入高中階段的學習對高中的學習方法和技巧沒有更多的深入，而且初三沒有學習生物學科，我在上課的過程中注意學生生物學科的學習方法和技巧的培養，培養學生的生物學思維和生物學的學習方法，例如讓學生多參與實驗，設計實驗，體驗生物學科是實驗科學；為學生盡可能多地提供動腦動手的機會，培養學生的發散思維、想象力，初步培養科研的思維。
一、課堂前教案分析
（一）教學目標
知識目標：了解細胞膜的成分、結構和功能。能力目標：進行用哺乳動物紅細胞制備細胞膜的實驗；體驗制備細胞膜的方法；探討在建立生物膜模型的過程中，實驗技術的進步所起的作用。情感態度目標：認同細胞膜作為系統的邊界對于細胞這個生命系統的重要意義；探討建立生物膜模型的過程如何體現結構與功能相適應的觀點。
（二）教學重點與難點
教學重點主要包括以下幾點：細胞膜的成分和功能；細胞膜對于細胞這個生命系統的重要意義。教學難點：用哺乳動物紅細胞制備細胞膜的方法。細胞膜對于細胞這個生命系統的重要意義。建立生物膜模型的過程如何體現結構與功能相適應的觀點。
（三）教學方法
教學方法有很多種，本次主要是運用以下的一些方法：引導探究，模型制作，小組合作，小先生講課，通過這些方法能很好地引導學生盡快地進入課堂氛圍，而且能夠親自參與到課堂教學中，增加同學們的學習興趣。
二、課堂教學過程設計
通過做一個演示實驗：兩個燒杯分別裝涼水和開水，同學上來操作，分別放入等量的玫瑰花瓣，用玻璃棒攪拌，請同學們觀察有什么現象？得出什么結論？通過這個觀察到的現象從而引出細胞膜的功能，鍛煉和培養學生的觀察和分析的能力，此部分大約用時5—8分鐘。
細胞膜的這么重要的功能，與什么有關？究竟又怎樣的結構決定的呢？首先要制備出真正的生物膜才能夠是由有說服力。此處是一個很重要的實驗，鑒于實驗材料和器材的顯示采用的方法是理論實驗，培養學生自己在腦中先預設實驗，用問題串的形式將該實驗需要的所有問題都引導出來。
我們選擇什么樣的材料來做這個實驗呢？（動物細胞，植物細胞，細菌類細胞，哺乳動物的成熟的紅細胞）你為什么選擇這樣的實驗材料，依據是什么？
你選擇了哺乳動物的成熟的紅細胞，接下來你如何操作能夠制備細胞膜呢？為什么要這樣操作？
細胞破裂后，如何才能將細胞膜取出來呢？用到了其他學科的什么知識？
制備了細胞膜，究竟含有哪些化合物？我采用的方法是沿著科學史的步伐，根據曾經的科學家們的實驗，看看同學的分析能力。
細胞膜的化學組成為：磷脂分子，蛋白質分子，多糖分子。這些化合物用什么樣的方式結合起來，能夠滿足我們前面分析的細胞膜的功能？提供材料：塑料板，磷脂模型，蛋白質模型，多糖模型。
分組：同學們六人一組，進行拼圖實驗，看看你做的模型怎樣才能滿足細胞膜的功能。
在這個過程中，學生會存在這樣那樣的問題，你的設計，為什么這樣設計，有不同意見的同學起來反駁，你的反駁理由是什么？這樣設計對不對，為什么？應該怎樣設計呢？邊設計邊訂正，到最后同學自己說服自己，制作出真正正確的磷脂雙分子層的流動鑲嵌模型。能夠讓學生充分理解為什么細胞膜要有這樣的結構，同時還鍛煉了學生設計實驗的能力，科學辯證的思維能力。
課堂快結束的時候，讓同學起來總結一下這節課你學習了什么？知識方面的收獲還有其他的收獲嗎？為了滿足不同層次的學生的需求，采用分層次布置作業，基礎的部分+能力提高部分。有興趣的同學上網查資料，細胞膜上的甲胎蛋白與人體健康。
三、小結
高中生物教學方法多種多樣，本文旨在對學生生物學科的學習方法和技巧的培養，培養學生的生物學思維和生物學的學習方法，為學生盡可能多的提供動腦動手的機會，培養學生的發散思維、想象力，初步培養科研的思維。
【參考文獻】
［1］馮文琪.淺談如何在高中生物教學中培養學生的探究能力[J].新課程（中），2011（2）.
